best365官网登陆_365bet体育投注在线_beat365在线平台网址 乳酸粪肠球菌对抗生素耐受性试验研究报告
江西农业大学江西省高校动物营养重点实验室     南昌 瞿明仁  330045
宜春best365官网登陆_365bet体育投注在线_beat365在线平台网址 生物科技有限公司      宜春 钟启平   336000

     笔者注：本试验是探讨best365官网登陆_365bet体育投注在线_beat365在线平台网址 复合菌中的乳酸菌部分，对常规抗生素的耐受性试验，是best365官网登陆_365bet体育投注在线_beat365在线平台网址 公司与江西农大协同创新产学研合作项目之一。
       摘要：随着国家对动物饲料中添加药的规范，以及烈性传染性疾病的减少，饲料中添加药物越来越少，为微生态制剂的应用提供了应用前景。为此，本文对宜春best365官网登陆_365bet体育投注在线_beat365在线平台网址 生物科技有限公司生产的乳酸粪肠球菌对常见抗生素、不同pH值、牛瘤胃液、人工胃液、人工肠液及胆盐的耐受性，以及对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的抑制作用进行了研究。
      结果发现乳酸粪肠球菌对饲料中国家允许添加的7种常规药物有不同程度的耐受性：其中对阿散酸的耐受性最强、其次为杆菌肽锌；对金霉素、喹乙醇、硫酸粘杆菌的耐受性均在国家规定添加量以上；但也发现对吉他霉素、盐霉素的耐性较差。试验还表明该乳酸粪肠球菌对大肠杆菌有较强的抑菌作用。
      乳酸粪肠球菌是一种微生态制剂，主要成分是可与动物共生的有益微生物群，对于改善动物胃肠功能，促进生长和提高生产性能具有明显的功能。在生产实践中使用普遍或滥用抗生素及兽药，耐药性问题、兽药残留问题直接影响着我国动物性食品的质量，也影响了生微生态制剂在生产中的应用。因此国家对动物饲料中添加药的控制也越来越严格，因此，研究、开发及应用新型微生态制剂是今后发展的方向，为此，笔者对宜春best365官网登陆_365bet体育投注在线_beat365在线平台网址 生物科技有限公司生产的乳酸粪肠球菌进行了对常见抗生素、不同pH值、牛瘤胃液、人工胃液、人工肠液及胆盐的耐受性，以及对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的抑制作用研究，预期为微生态制剂在饲料中应用提供理论基础。
      本文为抗生素耐受性试验结果

1. 材料与方法
1.1、材料
1.1.1、药物及主要试剂：15%金霉素、15%杆菌肽锌、99%阿散酸、98%喹乙醇、10%硫酸粘杆菌素、50%吉他霉素、12%盐霉素，由江西省某饲料公司技术部惠赠。无菌生理盐水、1mol/L NaOH溶液由实验室自行配制；
1.1.2、培养基：
      LB培养基、HM（Mueller-Hinton）培养基，购自长城生物公司。
1.1.3、参照菌株：
      乳酸粪肠球菌标准菌株ATCC 29212；质控菌株：金黄色葡萄球菌ATCC 25923，购自南昌市长城生物有限公司。受试菌株：大肠杆菌K88菌株、金黄色葡萄球菌购自南昌市长城生物公司；鸡白痢沙门氏菌，由江西农业大学预防兽医学教研组保存。
1.1.4、试验对象：
      best365官网登陆_365bet体育投注在线_beat365在线平台网址 乳酸粪肠球菌，由宜春best365官网登陆_365bet体育投注在线_beat365在线平台网址 生物科技有限公司提供。

1.2、方法：
1.2.1、乳酸粪肠球菌对抗生素的耐受性试验
      本试验严格根据美国临床试验室标准委员会(NCCLS)推荐的琼脂稀释法测定7种抗菌药对乳酸粪肠球菌的最低抑菌浓度(MIC)和最高耐药浓度。
1.2.1.1、抗生素溶液的准备
      按《全国临床检验操作规程》将7种抗菌药物分别用相应试剂溶解后，用灭菌双蒸水稀释成5,120μg/mL的储存液，-80℃保存备用。试验时用灭菌双蒸水稀释至所需浓度。使用时再稀释成各种所需要的浓度。具体见表1。

表1：抗菌药物浓度稀释的配制方案 

1.2.1.2、菌液的准备与接种
      将送检乳酸粪肠球菌，接种于MH固体培养基，置37℃培养18-24小时，再分离纯化乳酸粪肠球菌为试验菌种。（编者注：由于本试验采用了将送检样品中的乳酸粪肠球菌分离纯化后，再进行耐抗生素试验，所以，还没有完全反映出best365官网登陆_365bet体育投注在线_beat365在线平台网址 乳酸粪肠球菌生产工艺中所采取的包埋保护后的耐受抗生素的效果）
      从平板上挑取单个菌落于LB液体培养基中，置37℃ 150rpm摇菌5h左右，并用LB液体培养基稀释至OD₆₃₀值为0.1(相当于细菌数1~2×10⁸ CFU/mL)备用。
      将抗菌药储存液倍比稀释成12个药物浓度（含原液13个浓度），将各浓度抗菌药各取2mL置无菌平皿，迅速加入18mL灭菌并冷却至约50℃的MH固体培养基混匀，倾注平板。使各平皿中药物最终浓度倍比稀释。庆大霉素仅制成浓度为500μg/mL的MH平板。
      再将菌液调整到浓度为l×10⁷ CFU/mL，分别取1μL菌液接种于加好药物的MH平板上，细菌最终接种量为1×10⁴ CFU/mL，置37℃恒温需氧环境培养18~24小时。观察细菌菌落生长情况。

1.2.1.3、药敏试验质量控制：
      每批实验以金黄色葡萄球菌ATCC 25923作常规药敏的质控菌株，以完全抑制菌落生长的最低药物浓度为MIC；以乳酸粪肠球菌标准株ATCC 29212作庆大霉素高水平耐药筛选质控菌株，在含500μg/mL庆大霉素的MH平板上不生长。实验重复两次，取两次结果平均数。质控结果均符合NCCLS2008年颁布的药物敏感试验解释标准。

1.2.2、乳酸粪肠球菌抑菌试验：采用牛津杯扩散法

1.2.2.1、将试验菌株大肠杆菌K88菌株、鸡白痢沙门氏菌、金黄色葡萄球菌ATCC 25923复苏，分别接种营养琼脂培养基37℃培养18-24小时，从平板上挑取单个菌落于LB液体培养基中，置37℃ 150rpm摇菌5h左右，并用LB液体培养基稀释至OD₆₃₀值为0.1(相当于细菌数1~2×10⁸ CFU/mL)备用。

1.2.2.2、将乳酸粪肠球菌接种于MH固体培养基37℃培养18-24小时，钩菌于无菌蒸馏水，稀释到2×10⁹ CFU/mL为乳酸粪肠球菌实验用。

1.2.2.3、倾注营养琼脂培养基于平皿，每平皿药20mL培养基；冷却后置37℃恒温箱保温24h，以无任何微生物生长为合格培养基。将平皿正面朝上，置一水平桌面，迅速将灭菌牛津杯小心置于琼脂培养基，轻按，小心加入菌生素（2×10⁹ CFU/mL），每孔100μL，迅速加盖。

1.2.2.4、小心将加有牛津杯的平皿置37℃恒温箱培养24h，观察牛津杯周围的抑菌圈，并记录结果于下表。

2、结果
2.1、乳酸粪肠球菌对抗生素的耐受性试验结果
      对抗生素耐受性试验结果表明，该菌对七种抗生素有不同程度的耐受性，其对阿散酸耐受性最强，其次为杆菌肽锌，以下依次为喹乙醇、金霉素、硫酸粘杆菌素（抗敌素）、盐霉素，对吉它霉素耐受性最次，但仍然有较好的耐受性表现，具体见表2，图1~图7。

表2：乳酸粪肠球菌对七种抗生素的耐受性试验结果 

图1：耐金霉素试验结果

      图注：培养基中加有不同浓度的药物，加入相同数量的菌液于培养基表面，37℃恒温需氧环境培养18~24小时，如有菌落生长，即表示该菌能耐受该浓度的药物（下同），图1中第5块平皿开始有菌落出现，该平皿中金霉素为浓度160ppm，即该菌能耐受160ppm金霉素，而MIC即为320ppm。

图2：耐杆菌肽锌试验结果 

图3：耐阿散酸试验结果

图4：耐喹乙醇试验结果

图5：耐硫酸粘杆菌素试验结果

图6：耐吉他霉素试验结果

图7：耐盐霉素试验结果

2.2、乳酸粪肠球菌抑菌试验结果

     试验结果乳酸粪肠球菌对三种病原菌均有一定的抑菌能力，且对大肠杆菌有较强的抑制作用（笔者注：这一点在江西省农业科学院的养殖试验中也得到了体现，排泄的粪便中，添加乳酸粪肠球菌的试验组的粪便中的大肠杆菌数量比对照组要低85%之多），具体见表3图8。

表3：乳酸粪肠球菌抑菌试验结果 

图8：乳酸粪肠球菌抑菌试验结果图

3：小结与讨论

3.1、本次试验结果表明，best365官网登陆_365bet体育投注在线_beat365在线平台网址 乳酸粪肠球菌对7种药物有不同程度的耐药作用，其中对阿散酸效果最好，在最高浓度下均不能抑制乳酸粪肠球菌生长，其可以耐受2560ppm浓度的阿散酸浓度，超出国家规定添加量的200多倍；其次为杆菌肽锌，耐受浓度为1280ppm；其它如金霉素、喹乙醇、硫酸粘杆菌均在国家规定添加量以上。但对吉他霉素、盐霉素的耐性相对较差。

3.2、本次试验了对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和K88大肠杆菌的抑菌试验，试验结果乳酸粪肠球菌对三种病原菌均有一定的抑菌能力，且对大肠杆菌有较强的抑制作用