best365官网登陆_365bet体育投注在线_beat365在线平台网址 乳酸粪肠球菌对胆盐和胃液及肠液的耐受性试验研究报告
江西农业大学江西省高校动物营养重点实验室  南昌瞿明仁  330045
宜春best365官网登陆_365bet体育投注在线_beat365在线平台网址 生物科技有限公司   宜春钟启平   336000

     笔者注：本试验是探讨best365官网登陆_365bet体育投注在线_beat365在线平台网址 复合菌中的乳酸菌部分，对胆盐和胃肠液的耐受性试验，是best365官网登陆_365bet体育投注在线_beat365在线平台网址 公司与江西农大协同创新产学研合作项目之一。
      摘要：随着国家对动物饲料中添加药的规范，以及烈性传染性疾病的减少，饲料中添加药物越来越少，为微生态制剂的应用提供了应用前景。为此，本文对宜春best365官网登陆_365bet体育投注在线_beat365在线平台网址 生物科技有限公司生产的乳酸粪肠球菌对常见抗生素、不同pH值、牛瘤胃液、人工胃液、人工肠液及胆盐的耐受性，以及对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的抑制作用进行了研究。
      乳酸粪肠球菌是一种微生态制剂，主要成分是可与动物共生的有益微生物群，对于改善动物胃肠功能，促进生长和提高生产性能具有明显的功能。在生产实践中使用普遍或滥用抗生素及兽药，耐药性问题、兽药残留问题直接影响着我国动物性食品的质量，也影响了生微生态制剂在生产中的应用。因此国家对动物饲料中添加药的控制也越来越严格，因此，研究、开发及应用新型微生态制剂是今后发展的方向，为此，笔者对宜春best365官网登陆_365bet体育投注在线_beat365在线平台网址 生物科技有限公司生产的乳酸粪肠球菌进行了对常见抗生素、不同pH值、牛瘤胃液、人工胃液、人工肠液及胆盐的耐受性，以及对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的抑制作用研究，预期为微生态制剂在饲料中应用提供理论基础。
      对胆盐的耐受能力不同浓度相差不大，但随处理时间延长，存活率明显下降；在处理3小时后，存活下降到40%。
      乳酸粪肠球菌对牛瘤胃酸性耐受较强，尤其是对天然牛瘤胃液耐受性强，处理5小时后，仍有近70%的存活率；对人工胃液耐受性相对低一些，2小时后，存活率为60%左右，但处理5小时后，存活率降至28%。
      本文为乳酸粪肠球菌对胆盐和胃液及肠液的耐受性试验结果。 

1. 材料与方法
1.1、材料
1.1.1、药物及主要试剂：无菌生理盐水、1mol/L NaOH溶液由实验室自行配制；盐酸、胃蛋白酶、胰蛋白酶购自长城生物公司。
1.1.2、培养基：LB培养基、HM（Mueller-Hinton）培养基，购自长城生物公司。
1.1.3、参照菌株：乳酸粪肠球菌标准菌株ATCC 29212；质控菌株：金黄色葡萄球菌ATCC 25923，购自南昌市长城生物有限公司。
1.1.4、试验对象：乳酸粪肠球菌，由宜春best365官网登陆_365bet体育投注在线_beat365在线平台网址 生物科技有限公司提供。

1.2、方法：
1.2.1、不同胆盐处理对乳酸粪肠球菌存活率的影响
      取1g乳酸粪肠球菌分别加入0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的胆盐溶液各9mL，混匀于室温中分别处理30min、1h、2h、3h。
      处理后溶液用无菌生理盐水做10^-1、10^-2、10^-3……10倍递度稀释，在10^-5~10^-6两个稀释度各取0.1mL，加入无菌平皿；同时取未经胆盐处理的乳酸粪肠球菌也做10倍递度稀释，取10^-5~10^-6两个稀释度为对照。将溶化后冷却至50℃的MH培养基迅速倾注平皿，小心混匀。置37℃恒温培养24小时，观察并记数。以上样品均重复两次以上，以平均数为准。
      乳酸粪肠球菌存活率=处理后活菌数/未处理活菌数×100。

1.2.2、乳酸粪肠球菌对胃液的敏感性实验
      取1g乳酸粪肠球菌分别加入人工胃液、牛胃液各9mL，混匀于室温中分别处理于1h、2h、3h、4h、5h。
      处理后溶液用无菌生理盐水做10^-1、10^-2、10^-3……10倍递度稀释，在10^-5~10^-6两个稀释度各取0.1mL，加入无菌平皿；同时取未经胃液处理的乳酸粪肠球菌也做10倍递度稀释，取10^-5~10^-6两个稀释度为对照。将溶化后冷却至50℃的MH培养基迅速倾注平皿，小心混匀。置37℃恒温培养24小时，观察并记数。以上样品均重复两次以上，以平均数为准。
      乳酸粪肠球菌存活率=处理后活菌数/未处理活菌数×100。

1.2.3、乳酸粪肠球菌对肠液的敏感性实验
      取1g乳酸粪肠球菌加入肠液各9mL，混匀于室温中分别处理于2h、4h、6h、8h、10h。
      处理后溶液用无菌生理盐水做10^-1、10^-2、10^-3……10倍递度稀释，在10^-5~10^-6两个稀释度各取0.1mL，加入无菌平皿；同时取未经肠液处理的乳酸粪肠球菌也做10倍递度稀释，取10^-5~10^-6两个稀释度为对照。将溶化后冷却至50℃的MH培养基迅速倾注平皿，小心混匀。置37℃恒温培养24小时，观察并记数。以上样品均重复两次以上，以平均数为准。
      乳酸粪肠球菌存活率=处理后活菌数/未处理活菌数×100。

2、结果
2.1、不同胆盐处理对乳酸粪肠球菌存活率影响试验结果
      从图表中可见，乳酸粪肠球菌在胆盐处理后，随时间延长，菌数均呈下降趋势；而不同浓度来看，随着胆盐浓度上升，菌数基本是遵循胆盐浓度越高，菌数越低的规律。从图可见，在30min内，存活均比较高；在1-2小时是一个明显的变化阶段，到第3小时后，四个不同的胆盐浓度下，菌均下降明显，而且菌落比较接近。具体试验结果见表1、表2和图1、图2。

表1：胆盐处理后，乳酸粪肠球菌计数结果(单位: ×10¹⁰ CFU/g) 

表2：胆盐处理后，乳酸粪肠球菌存活率 

图1：不同浓度胆盐处理后，菌数变化图

图2：不同浓度胆盐处理后，乳酸粪肠球菌存活率变化图 

2.2、乳酸粪肠球菌对天然牛瘤胃液、人工胃液的敏感性试验结果
      从表3、图4、表3、图4可见，乳酸粪肠球菌对天然牛瘤胃液耐受性比较强，通过天然牛瘤胃液处理3小时，存活仍有95%以上，到第5小时仍有66.5%的菌存活。而对人工胃液的耐受性明显下降，经人工胃液处理1小时，存活率就下降到81%；第2小时，存活率就仅有61左右；第3小时后，又有近一半死亡，存活率仅37.93%；第4小时后，存活率不到30%。 

表3：乳酸粪肠球菌耐天然牛瘤胃液试验结果 

表4：乳酸粪肠球菌耐人工胃液试验结果 

图3：乳酸粪肠球菌在天然牛瘤胃液和人工胃液中存活率变化图 

2.3、乳酸粪肠球菌对人工肠液的敏感性试验结果
      结果显示，乳酸粪肠球菌对人工肠液有一定的耐受性。在2小时内，存活率达98.16%；4小时后存活率仍有72.64%。但到第6小时后，存活率明显下降，不到50%，到第8小时降到40%以下，10小时后，则降到30%以下。具体结果见表5、图5。

表5：乳酸粪肠球菌耐人工肠液试验结果 

图5：乳酸粪肠球菌在人工肠液不同时间处理后的存活率变化图

3：小结与讨论
3.1、本菌对胆盐的耐受能力与不同胆盐浓度处理结果生存率相差不大，尤其是0.2%、0.3%、0.4%、三个胆盐浓度处理后，差异不显着；0.5%胆盐浓度处理后，有一定的差异。但与处理时间密切相关，即处理时间越长，存活率下降明显。在处理3小时后，存活均不到40%，考虑到乳酸菌的脆弱性，本试验结果表明，本试验乳酸粪肠球菌对胆盐的耐受能力很强。

3.2、在对胃液敏感性试验中发现，乳酸粪肠球菌对天然牛瘤胃液耐受性比较强，通过天然牛瘤胃液处理3小时，存活仍有95%以上，到第5小时仍有66.5%的菌存活。而对人工胃液的耐受性明显下降，经人工胃液处理1小时，存活率就下降到81%；第2小时，存活率就仅有61左右；第3小时后，又有近一半死亡，存活率仅37.93%；第4小时后，存活率不到30%，在乳酸菌中，这个存活率是比较高的。
分析其原因可能与人工胃液是模真胃环境有关，在真胃环境中，胃酸浓度高，对乳酸粪肠球菌杀伤作用强；而在天然牛瘤胃液中，PH在中性，所以乳酸粪肠球菌存活率高。

3.3、本试验结果发现，乳酸粪肠球菌对人工肠液的耐受性在4小时内比较强，与天然牛瘤胃液类似：处理2小时存活率98.16%，处理4小时后，存活率72.64%。而在4小时以上时，存活率就比较低，第6小时存活率48.28%，第10小时存活率仅28%，但很显然，本试验乳酸粪肠球菌在肠液中具有较强的生存率。